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    1.熱變性及酸堿變性沉淀法 用于選擇性的除去某些不耐熱及在一定PH值下易變性的雜蛋白。

　　2.有機(jī)溶劑沉淀法 多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化，有時(shí)也用于蛋白質(zhì)沉淀。

　　3.等電點(diǎn)沉淀法 用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其它兩性物質(zhì)的沉淀。但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合使用。

　　4.非離子多聚體沉淀法 用于分離生物大分子。

　　5.生成鹽復(fù)合物沉淀 用于多種化合物，特別是小分子物質(zhì)的沉淀。

　　6.鹽析法 多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。

　　鹽析法

　　一般來(lái)說(shuō)，所有固體溶質(zhì)都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過(guò)程叫鹽析。在生化制備中,許多物質(zhì)都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離，如蛋白質(zhì)、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白質(zhì)沉淀zui為常見(jiàn)，特別是在粗提階段。

　　鹽析法分為兩類(lèi)，*類(lèi)叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過(guò)改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)，用于早期的粗提液;第二種叫b分段鹽析法，在一定離子強(qiáng)度下通過(guò)改變PH和溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)，用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶。

　　一.影響鹽析的若干因素

　　1.蛋白質(zhì)濃度

　　高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，但許多蛋白質(zhì)的b 和Ks常數(shù)十分接近，若蛋白濃度過(guò)高，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的共沉淀作用;在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，而共沉淀作用比較少，因此需要在兩者之間進(jìn)行適當(dāng)選擇。用于分步分離提純時(shí)，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液，多加一點(diǎn)中性鹽，使共沉淀作用減至zui低限度。一般認(rèn)為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中。

　　2.離子強(qiáng)度和類(lèi)型

　　一般說(shuō)來(lái)，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。在進(jìn)行分離的時(shí)候，一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。每一組分被鹽析出來(lái)后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來(lái)。

　　離子種類(lèi)對(duì)蛋白質(zhì)溶解度也有一定影響，離子半徑小而很高電荷的離子在鹽析方面影響較強(qiáng)，離子半徑大而低電荷的離子的影響較弱，下面為幾種鹽的鹽析能力的排列次序：磷酸鉀>硫酸鈉>磷酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂。

　　3.PH值

　　一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度zui小。為提高鹽析效率，多將溶液PH值調(diào)到目的蛋白的等電點(diǎn)處。 但必須注意在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與高鹽濃度下所測(cè)的結(jié)果是不同的，需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整溶液PH值，以達(dá)到的鹽析效果。

　　4.溫度

　　在低離子強(qiáng)度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質(zhì)、酶和多肽類(lèi)物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質(zhì)對(duì)鹽析溫度無(wú)特殊要求，可在室溫下進(jìn)行，只有某些對(duì)溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進(jìn)行。

　　二.硫酸銨的使用

　　硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對(duì)蛋白質(zhì)巰基有敏感作用，使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H2S飽和，放置過(guò)夜，用濾紙除去重金屬離子，濃縮結(jié)晶，100℃烘干后使用。另外，高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性(PH=5.0左右)，使用前也需要用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需PH。

　　硫酸銨的加入有以下幾種方法：1)加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況;2)加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來(lái)溶液體積不大的情況;3)透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析，透析袋內(nèi)硫酸銨飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后，目的蛋白析出，停止透析。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但手續(xù)煩瑣，需不斷測(cè)量飽和度，故多用于結(jié)晶，其它情況少見(jiàn)。

　　使用固體硫酸銨時(shí)：1)必須注意飽和度表中規(guī)定的溫度，一般有0℃或室溫兩種，加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中;2)分段鹽析中，應(yīng)考慮每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化。一種蛋白質(zhì)如經(jīng)二次透析，一般來(lái)說(shuō)，*次鹽析分離范圍(飽和度范圍)比較寬，第二次分離范圍較窄。3)鹽析后一般放置半小時(shí)至一小時(shí)，待沉淀*后才過(guò)濾或離心。過(guò)濾多用于高濃度硫酸銨溶液，因?yàn)榇朔N情況下，硫酸銨密度較大，若用離心法需要較高離心速度和長(zhǎng)時(shí)間的離心操作，耗時(shí)耗能。離心多用于低濃度硫酸銨溶液。

　　有機(jī)溶劑沉淀法

　　有機(jī)溶劑的沉淀機(jī)理是降低水的介電常數(shù)，導(dǎo)致具有表面水層的生物大分子脫水，相互聚集，zui后析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于：1)分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀;2)沉淀不用脫鹽，過(guò)濾較為容易;3)在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。其缺點(diǎn)是對(duì)具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作要求在低溫下進(jìn)行?？傮w來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。

　　有機(jī)溶劑的選擇首先是能和水混溶，使用較多的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。

　　有多種因素影響有機(jī)溶劑的沉淀效果：1)溫度 低溫可保持生物大分子活性，同時(shí)降低其溶解度，提高提取效率;2)樣品濃度和PH 與鹽析法中的作用基本相同;3)金屬離子一些多價(jià)陽(yáng)離子如Zn2+和Ca2+在一定PH下能與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物在水中或有機(jī)溶劑中的溶解度都大大下降，而且不影響蛋白質(zhì)的生物活性。4)離子強(qiáng)度 鹽濃度太大或太低都對(duì)分離有不利影響，對(duì)蛋白質(zhì)和多糖而言鹽濃度不超過(guò)5%比較合適，使用的乙醇量不超過(guò)二倍體積為宜。

　　其他沉淀法

　　一.等電點(diǎn)沉淀法

　　兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時(shí)溶解度zui低，不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。如工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時(shí)，在粗提液中先調(diào)PH8.0去除堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)PH3.0去除酸性蛋白質(zhì)。

　　利用等電點(diǎn)除雜蛋白時(shí)必須了解制備物對(duì)酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險(xiǎn)。 不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點(diǎn)會(huì)發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時(shí)，必須注意調(diào)整PH值。 等電點(diǎn)法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。

　　二.生成鹽復(fù)合物沉淀法

　　1.金屬?gòu)?fù)合鹽法

　　許多有機(jī)物質(zhì)包括蛋白在內(nèi)，在堿性溶液中帶負(fù)電荷，能與金屬離子形成沉淀。根據(jù)有機(jī)物與它們之間的作用機(jī)制，可分為羧酸、胺及雜環(huán)等含氮化合物類(lèi)，如銅鋅鎘;親羧酸疏含氮化合物類(lèi)，如親硫氫基化合物類(lèi)。蛋白質(zhì)-金屬離子復(fù)合物的重要性質(zhì)是它們的溶解度對(duì)溶液的介電常數(shù)非常敏感，調(diào)整水溶液的介電常數(shù)(如加入有機(jī)溶劑)，即可沉淀多種蛋白。

　　2. 有機(jī)鹽法

　　含氮有機(jī)酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。但此法常發(fā)生不可逆的沉淀反應(yīng)，故用于制備蛋白質(zhì)時(shí)，需采用較溫和的條件，有時(shí)還需加入一定的穩(wěn)定劑。

　　3.無(wú)機(jī)復(fù)合鹽法

　　如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等。

　　以上鹽類(lèi)復(fù)合物都具有很低的溶解度，極易沉淀析出。若沉淀為金屬?gòu)?fù)合鹽，可通以H2S使金屬變成硫化物而除去，若為有機(jī)酸鹽或磷鎢酸鹽，則加入無(wú)機(jī)酸并用C4H10O萃取，把有機(jī)酸和磷鎢酸等移入C4H10O中除去，或用離子交換法除去。值得注意的是此類(lèi)方法常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀，應(yīng)用時(shí)必須謹(jǐn)慎。

　　三. 選擇性變性沉淀

　　其原理是利用蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子對(duì)某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀，以達(dá)到分離提純的目的。

　　此方法可分為：1)利用表面活性劑或有機(jī)溶劑引起變性;2)利用對(duì)熱的不穩(wěn)定性,加熱破壞某些組分，而保存另一些組分;3)酸堿變性。

　　四.非離子多聚物沉淀法

　　非離子多聚物是六十年代發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)重要沉淀劑，zui早用于提純免疫球蛋白、沉淀一些細(xì)菌和病毒，近年來(lái)逐漸廣泛應(yīng)用于核酸和酶的分離提純。這類(lèi)非離子多聚物包括不同分子量的聚乙二醇、NPEO、葡聚糖、右旋糖酐硫酸鈉等，其中應(yīng)用zui多的是聚乙二醇。

　　用非離子多聚物沉淀生物大分子和微粒，一般有兩種方法：1)選用兩種水溶性非離子多聚物組成液液兩相體系，不等量分配，而造成分離。此方法基于不同生物分子表面結(jié)構(gòu)不同，有不同分配系數(shù)。并外加離子強(qiáng)度、PH值和溫度等影響，從而擴(kuò)大分離效果。2)選用一種水溶性非離子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。該方法操作時(shí)先離心除去大懸浮顆粒，調(diào)整溶液PH值和溫度至適度，然后加入中性鹽和多聚物至一定濃度，冷貯一段時(shí)間，即形成沉淀。